ICSI-proceduren, Fertilitetslab

Formål
At inseminere oocytten ved mikroinsemination for at opnå befrugtning. Denne metode vælges, når sædkvaliteten er nedsat (<2 mill. progressivt motile sædceller efter oprensning) eller ved ingen PN eller lav 2PN rate (<30%) ved forudgående IVF-behandling. Metoden anvendes ligeledes, når 50/50 er valgt som behandlingsform.
Derudover anvendes ICSI ved ægdonation. Ved donation af > 8 æg, kan de resterende æg (nr. 9 til..) befrugtes med IVF, hvis sædprøven er egnet til IVF.

Målgrupper og anvendelsesområde
Bioanalytikere, der foretager mikroinsemination i forbindelse med fertilitetsbehandling.

Fremgangsmåde: apparatur, utensilier, medier
Metode
Se også "Witness" vejledningen under lokale SOP'er på p.drev.
Ved hjælp af et mikroskop og mikromanipulatorer fastholdes oocytten og en immobiliseret sædcelle injiceres intracytoplasmatisk.
Angående aktuel version og batchnumre på anvendt apparatur, utensilier og medier: se utensilie liste for aktuel dato
Apparatur
Flowbænk
Mikroskop med 10-, 20- og 40-X objektiver
Micromanipulatorer
Inkubator
Stereomikroskop
Utensilier
Dyrkningsskål.
ICSI-skål
Embryoslide eller dyrkningsskål
Pipette 10-100 μl + sterile spidser
145 µm pipette
Holdepipette
ICSI-pipette
Spidsglas
CO2–bobleflaske tilsluttet ”klokke”
Medier
-se klargøring af skåle

Fremgangsmåde
Dag 0 
- ICSI-skålene fyldes om morgenen/formiddagen, typisk efter aspiration: se klargøring af skåle. Skålene sættes i inkubator på hylden, der er tildelt kvinden.
- Montering af ICSI- og holdepipette: Sprøjte og slanger til ICSI-pipette skal være fyldt med olie (hvis dette bliver anvendt). Tjek, at der ikke er luftbobler i systemet, da det vil påvirke stabiliteten. Kontrollér at manipulatoren til holdepipetten og andre luft-pipetter ikke er i bund. Montér og indstil ICSI-pipetten og holdepipetten i samme niveau. Indstil vinklerne på pipetterne til ca. 30 grader og tjek at joystickene er i midterposition.
Denudering af oocytter
- Umiddelbart før oocytterne skal injiceres og overføres til injektionsskål, skal cumuluscellerne fjernes = denuderes. Dette må tidligst udføres kl. 11.30 eller 2 timer efter aspirationen, der foretages 35-37 timer efter ægløsningssprøjten (hCG eller GnRHagonist). Vent gerne 3-4 timer hvis aspirationen er tidligt på formiddagen, dog ikke længere end 6 timer.
- Hyaluronidase tages ud af køleskab og sættes på varmen i flowbænken ca. 20 min. før brug (herefter kan den blive stående på varmen til brug ved dagens ICSIér).
- Dyrkningsskål mærket ”Hya” (Kaldet Hya-skål) tages ud af inkubatoren og de store dråber med Cleavage suges op af skålen og erstattes med Hyadase. Alt efter hvor mange Hya-skåle og oocytter, man har, kan der være flere skåle. Alternativt kan hya-dråberne skiftes undervejs.
- X-antal oocytter overføres med en Eppendorf pipette til hya-dråber i skålen. Er der flere oocytter tilbage i den igangværende 4-kammerskål, sættes denne under ”klokke” (dog ikke i ICSI flowbænk hvor temperaturen vil være for høj under ”klokken”) eller tilbage i inkubator, mens de første oocytter denuderes.
- Ved hjælp af først Eppendorf pipette og dernæst 145 µm pipette føres oocytterne op og ned i pipettespidsen indtil cumuluscellerne er opløst (oocytterne må dog højst ligge 30 sek. i hyaluronidasen). Når størstedelen af cumuluscellerne er løsnet fra oocytten, skylles oocytterne med 145 µm pipette i de mindre dråber Cleavage i Hya-skålen. Pipetten tømmes for Hyadase ved flytning fra dråbe til dråbe. Når oocytterne er i sidste dråbe, placeres de derefter enkeltvis i ICSI-skålens dråber efter skylning i ekstradråberne. 4-6 æg pr. skål. 
- Udover RI Witness kontrollerer 2 bioanalytikere at navn og CPR-nr. på den færdigoprensede sædprøve stemmer overens med navn og CPR-nr. på ICSI-skålen. Initialer for begge bioanalytikere noteres i rubrik på ASP-skemaet. Sædprøven opslemmes og ca. 2 μl afpipetteres i PVP-dråben i midten af ICSI-skålen. Efter tilsætning af sædprøven aftørres Eppendorf pipetten med sterilt vand.
- Ved mere end én ICSI-skål, sættes ICSI-skål nr. 2 og fremefter på kvindens inkubator-hylde.
Injektion af oocytter
’Trafikregel’: Gå ind og ud af dråben kl. 3
Tjek at varmepladen på mikroskopet er indstillet på korrekt temperatur (denne kan aflæses på temperaturlog’en).
- ICSI-skålen placeres centralt på varmepladen på mikroskopet. ICSI-proceduren udføres ved 400 gange forstørrelse (40X objektiv + 10X i okularet) eller 200 gange forstørrelse (20X objektiv + 10X i okularet) Det kan være en fordel at finde sædceller ved den største forstørrelse. Når man går i gang, findes ICSI pipetten lettest ved at starte med mindste forstørrelse.
- Fokusér på kanten af PVP-dråben. Kør ICSI-pipetten ned i PVP-dråben indtil pipetten er i fokus. Placer pipetten omkring kl. 9 eller kl. 3 i PVP-dråben med dråbens kant i synsfeltet. Stil skarpt på sædcellerne og undgå den mørke ’skyggeside’ i dråben. Sug lidt PVP op i ICSI-pipetten. Hold øje med at væskesøjlen er stabil og at der ikke trækkes for meget væske op – væsken skal ikke nå hen forbi knækket på pipetten.
- Vælg den sædcelle, der ser mest normal ud og som udviser regelmæssig og fremadrettet motilitet og immobiliser den ved hurtigt at trække og presse ICSI-pipetten hen over den nederste tredjedel af sædcellens hale fem gange, hvorved halen får et knæk. Denne påvirkning af sædcellen menes at medvirke til en sidste modning af sædcellen og er forbundet med en højere 2PN rate.
- Sug forsigtigt sædcellen op med halen først - undgå at berøre hoved og halsstykket.
- Hæv pipetten en smule op i dråben og før pipetten over til 1. dråbe med 1. oocyt.
- Der fokuseres på dråbens kant, hvorefter man finder oocytten, som placeres i midten af synsfeltet.
- Sænk ICSI-pipetten indtil den er i fokus og tjek om sædcellen stadig er i pipetten. Før holdepipetten ned i dråben, indtil den er i samme fokusplan som oocytten.
- Brug ICSI-pipetten og holdepipetten til at "trille" oocytten rundt for at tjekke for tilstedeværelse af ét pollegeme = MII. Injicér alle MII, men ikke GV- og MI-oocytter. Er man i tvivl om tilstedeværelse af ét pollegeme, skal oocytten dog injiceres.
- Vha. ICSI- og holdepipetten vendes oocytten, så pollegemet er orienteret klokken 11-12.
- Stil skarpt på oolemma og placer holdepipetten i samme niveau (dvs. oolemma og holdepipetten er lige skarpe). Med holdepipetten kl. 9 suges forsigtigt for at fastholde oocytten, hvorefter fokuseringen på oocyttens oolemma evt. skal finjusteres.
- ICSI-pipetten placeres så den er skarp i sammen niveau som oolemmaen og føres mod oocytten kl. 3.
- Placer sædcellen helt yderst i ICSI-pipetten og før ICSI-pipetten ind i oocytten. 
- Sug langsomt lidt af cytoplasmaet op i ICSI-pipetten, indtil membranen brydes, drej derefter kontra. Det er vigtigt at få så lidt cytoplasma op i ICSI-pipetten som muligt, da man ellers kan ødelægge cellens skelet med atresi eller forstyrret udvikling til følge.
- Injicer forsigtigt sædcellen i oocytten og træk ICSI-pipetten forsigtigt ud.
- Holdepipettens sug slippes og pipetten føres op og ud af dråben. Vær opmærksom på at oocytten ikke klæber til holdepipetten. 
- ICSI-pipetten føres lidt op. Der ”køres” tilbage til PVP-dråben for at "fange" den næste sædcelle.
- Modningsstadiet (GV, MI eller MII), om oocytten er blevet injiceret, initialer på bioanalytikeren, tidspunkt for denudering samt injicering registreres på ASP-skemaet.
- Når alle oocytterne i den igangværende ICSI-skål eller alle oocytter på pågældende patient er injiceret, overføres oocytterne til de tilsvarende slidebrønde/dyrkningsdråber (via skylledråberne) i den tilsvarende embryoslide eller dyrkningsskål (ét æg pr. brønd/dråbe). 
- Undtagelse ved brug af Ca++ (calciumionophore, fremmer aktivering af Ca++ i oocytten): Ved lav befrugtningsrate ved tidligere ICSI-behandlinger kan anvendelse af Ca++ være ordineret og vil være ”krydset” af i rubrik på Asp-skemaet. Ca++ - skål vil være klargjort dagen før (se forskrift for Klargøring). De injicerede oocytter (man kan med fordel vente til alle oocytter er injiceret) placeres i dråberne med Ca++ i 15 min., derefter skylles de i cleavagedråberne inden de overføres til embryoslide/dyrkningsskål.
- Næste ICSI-skål/de følgende oocytter behandles som ovenfor beskrevet.
- Embryoslidet sættes i Embryoskop ved at trykke på ”Add Slide” på skærmen. Tryk på knappen på lågen, når den lyser hvid, indsæt slide og luk lågen. På skærmen fremkommer pt’s navn + CPR.nr. – tryk ”OK” hvis det stemmer overens med det isatte slide. På næste skærmbillede tastes injiceringsstidspunkt samt antal æg i slidet, tryk ”OK”.
- Modningsstadiet for hver oocyt (GV, MI eller MII), samt hvilke oocytter der er blevet injiceret, registreres i Formatex. Desuden angives dato, tidspunkt samt initialer på den bioanalytiker, der har udført ICSI-proceduren. Der ”vinges af” på ASP-skemaet som kvittering for indtastede oplysninger. 
Dag 3
- På dag 3 skiftes dyrkningsmedie ved at suge 90 µl cleavagemedie op fra hver ”arm” i Embryoslidet med en Eppendorf pipette og derefter tilsætte 180 µl opvarmet blastocystmedie (indsat i inkubator 1 dagen før) til hver ”arm”. Dato samt initialer for bioanalytiker noteres på Asp-skema.
-

Tips ved problemer
- Hvis der er problemer med at pipetterne kommer i position ved isætning: Manipulatorerne kan være i yderpositioner. Sæt dem på midt-position før isætning af pipetter. Evt. juster ved hjælp af placering af pipette-holderens position i ”klemmen”.
- Hvis du pludselig ikke kan komme i en retning med eks. ICSI-pipetten: Den har nået en yderposition. Typisk skal der så ”skrues” på toppen af joysticket.
- Hvis spidsen af ICSI-pipetten ikke kan komme i niveau med sædcellerne: Pipetten er måske sænket for meget og står på hælen. Hæv pipetten og før den ned igen. Pipetten kan være indstillet i en forkert vinkel. 
- Hvis der kommer luft ud af pipetten i sæddråben: Drej kontra/sug så luftmængden begrænses. Flyt til anden del af dråben uden luftbobler og fortsæt.
- Hvis ICSI-pipetten er ustabil (suger og puster autonomt):
- 1) Der kan være kommet for meget væske op i ICSI-pipette. Tøm pipetten for væske og sug på ny PVP op. Tjek om det virker. Eller..
- 2) Skift pipette og tjek for luft i systemet inden en ny sættes i.
- Hvis der er ”snask” i ICSI-pipetten, så sædcellen hænger fast: Skift pipette!
- Hvis ICSI-pipetten er klistret: Skift pipette!
- Kommer der luftbobler ud i mediet ved ægget: Prøv at skubbe ægget væk. Hvis det ikke lykkes: Tag skålen med til flowbænken og flyt ægget til ny dråbe med 145 µm pipette. Er oocytten injiceret, flyttes det til embryoslide/ dyrkningsskål. 
- Hvis holdepipetten er ustabil: Dette skyldes oftest at der er suget for meget væske op. Kør pipetten op over olieniveau, tøm den og kør den ned igen.

Ansvar og organisering
Ledelsen er ansvarlig for det faglige indhold af instruksen, samt at den er implementeret.
Den enkelte bioanalytiker er ansvarlig for at kende og anvende instruksen.

Bilag
Bilag