Målgrupper og anvendelsesområde
Definitioner
Fremgangsmåde
Ansvar og organisering
Referencer, lovgivning og faglig evidens samt links hertil
Akkrediteringsstandarder
Bilag

Målgrupper og anvendelsesområde

Bioanalytikere, videnskabeligt personale, assistenter og molekylærbiologer.

Anvendes til forbehandling af væv (FFPE) til PCR analyser.

Definitioner

Ved hjælp af en optimal forbehandling af det paraffin indstøbte væv, bliver det muligt at ekstrahere tilstrækkeligt DNA til efterfølgende analysering.

Fremgangsmåde

Formål:

At sikre en ensartet procedure for oprensning af genomisk DNA fra formalin fikseret, paraffinindstøbt (FFPE) væv.

Teori:

Ved hjælp af en optimal forbehandling af det paraffin indstøbte væv, bliver det muligt at ekstrahere tilstrækkeligt DNA til efterfølgende analysering.

- Forbehandlinger sker ved behandling med TissueClear, ethanol og varme.

- Oprensning sker ved hjælp af QIAamp DNA FFPE Tissue Kit fra QIAGEN.

Sikkerhed:

Alt arbejde udføres i Grønt rum (ampliconfri zone). Der arbejdes i LAF-bænk med flow, samt med kittel og handsker.

Alt kemikalie affald opsamles i en plastik dunk mærket med kemikalieaffald til affaldstank. Affaldskategori Z.

For yderligere håndtering af kemikalier mm. henvises til afdelingens sikkerhedsinstruks for: Kemikalier, håndtering, opbevaring og bortskaffelse

Fremgangsmåde:

Forberedelse:

ATL buffer
- Før man starter proceduren skal man altid tjekke om der er dannet bundfald i ATL bufferen. Hvis dette er tilfældet (specielt ved levering af kittet) opløs bundfaldet ved at varme bufferen op til ca. 65-70 grader i varmeskab i ca. 10-15 min.
AL buffer
- Samme retningslinier som for ATL buffer.
AW1*
- Tilsæt 25 ml 99% ethanol til plastikflasken indeholdende 13 ml koncentreret AW1 buffer. Afkryds i tjek-boxen på label, for at indikere at dette er gjort samt noter dato og initialer.
- Fortyndet AW1 buffer kan holde sig ved stuetemperatur i op til et år efter fortyndingsdatoen.
- Inden brug omrystes den fortyndede buffer.
AW2*
- Tilsæt 30 ml 99% ethanol til plastikflasken indeholdende 13 ml koncentreret AW2 buffer. Afkryds i tjek-boxen på label, for at indikere at dette er gjort samt noter dato og initialer.
- Fortyndet AW2 buffer kan holde sig ved stuetemperatur i op til et år efter fortyndingsdatoen.
- Inden brug omrystes den fortyndede buffer.

* OBS det skal bemærkes at denatureret ethanol ikke er egnet til denne fortynding.

Ekstraktion:

Alt kemikalieaffald opsamles i en plastik dunk mærket med kemikalieaffald til affaldstank.

1 ml Tissueclear tilsættes FFPE snit.
Vortex kraftigt i min. 5 sek. og lad prøven stå ved stuetemp. i 10 min.
Centrifuger i 5 min. ved max speed (14.500rpm).
Ved meget paraffin: Udtag 500 μl tissueclear, og tilsæt igen 500 μl tissueclear. Ellers forsæt ved pkt. 6
Vortex kraftigt i min. 5 sek. og centrifuger i 2 min. ved max speed 14.500 rpm
Fjern så meget tissueclear som muligt, uden at fjerne vævet.
Tilsæt 1 ml 96-99% Ethanol.
Vortex kraftigt i min. 5 sek. og centrifuger i 2 min. ved max speed 14.500 rpm
Fjern så meget ethanol som muligt, uden at fjerne vævet.
Rest ethanol inddampes ved 56˚C i min. 10 min.
Tilsæt 180 μl ATL Buffer og 20 μl proteinase K og vortes kort.
Inkuber 1 time ved 56˚C og 450rpm.
Inkuber 1 time ved 90˚C og 450rpm. ”Herefter kan Qiacube anvendes.”
Bland og vortex i et nyt rør 200 μl AL Buffer og 200 μl Ethanol 96-99% pr. prøve.
Tilsæt 400 μl af AL/Ethanol blanding pr. prøve.
Vortex i min 5 sek.
Al prøveopløsning overføres til en id-mærket QIAamp MinElute søjle.
Centrifuger i 1 min. ved 14.500 rpm.
Søjle overføres til nyt rør og rest materialet i røret smides ud.
Tilsæt 500 μl AW1 buffer og centrifuger i 1 min. ved 14.500 rpm.
Søjle overføres til nyt rør og rest materialet i røret smides ud.
Tilsæt 500 μl AW2 buffer og centrifuger i 1 min. ved 14.500 rpm.
Søjle overføres til nyt rør og rest materialet i røret smides ud.
Centrifuger i 3 min. ved max speed (14.500rpm).
Søjle overføres til eppendorfrør.
Tilsæt 200 μl ATE buffer og inkuber i 5 min. ved stuetemp. Prøver til BRAFGT elueres i 50 μl ATE buffer (Prøver med sparsomt væv kan tilsættes mindre mængde ATE buffer end forskrevet)
Centrifuger i 1 min. ved 14.500 rpm.
Søjle smides ud, eluatet (indeholdende DNA) er nu klar til brug.