Fremgangsmåde
Teori:
BD Onclarity HPV Assay bruges til (kvalitativ) detektion af High-Risk HPV. Assayet baseres på amplifikation af DNA ved hjælpe af Polymerase Chain Reaction (PCR). Onclarity detekterer 14 HPV typer 16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,66&68 hvoraf de 6 typer rapporteres som single (16,18,31,45,51,52) mens de resterende 8 rapporteres i 3 genotype grupper (P1: 33/58, P2: 56/59/66, P3: 35/39/68).
BD Onclarity detekterer E6/E7 regionen af HPV genomet.
Onclarity assayet er designet til brug på BD Viper LT-instrumentet og valideret til brug med LBC prøver, både BD SurePath og PreservCyt Solution, samt BD CBD medie.
Reagenser:
- Kontroller: Hver kasse indeholder 24 positive og 24 negative kontroller.
HPV Positiv kontrol indhold:
- Ca 14430 kopier af HPV 16 plasmid
- Ca 8325 kopier af HPV 18 plasmid
- Ca 8418 kopier af HPV 56 plasmid
- Ca 3885 kopier af plasmid indeholdende en human beta-globin sekvens
- Carrier nucleic acid
HPV Negativ kontrol indhold:
- Carrier nucleic acid
- HPV Assay Reagent Pack: En kasse indeholder 2x96 G1 PCR tubes, G2 PCR tubes og G3 PCR tubes. Hver af disse indeholder bl.a. oligonucleotider, detektor prober, dNTPs og DNA ponymerase.
- LBC Diluent Tubes: En kasse indeholder 400 tubes/M-rør indeholdende 1,7 ml buffer (med salte, preservativ etc)
- PCR Extraction Tubes: En kasse indeholder 48 strips af 8 tubes hvert indeholdende 10 mg jernoxid i en opløselig film
- PCR Extraction Reagent Trough: Et Reagent Trough er opdelt i 5 indeholdende; 16,5 ml binding acid, 72,5 ml wash buffer, 25,4 ml Elution buffer, 19,4 ml Neutralization buffer med preservativ og 15,5 ml Waste Neutralization solution.
Alle information om lot nr og udløb logges i Viper LT-softwaren ved skift af lot. Informationerne for Kontroller og Reagent Trough bliver automatisk registreret mens de andre skal registreres manuelt.
Stabilitet:
LBC prøver kan opbevares i original vial op til 30 dage ved 2-30C, 180 dage ved 2-8C eller 180 dage ved -20C. Inden analyse overføres en aliquot på 0,5ml til et LBC Diluent tube (M-rør). Diluent tube indeholdende LBC prøvemateriale kan opbevares i 15 dage ved 2-30C eller op til 90 dage ved -20C.
Pre-warm:
Alle prøver skal forvarmes inden analysering for at lysere celler og frigive DNA til ekstraktion og amplifikation. Varmebehandlingen udføres af en BD Pre-warm station tilkoblet BD Viper LT-instrumentet. Pre-warm programmet tager 60 min hvor prøverne opvarmes til 120C i 30 min. Efter endt varmebehandling er prøverne klar til analysering på Viper LT-instrumentet.
Analyse på Viper LT-instrumentet:
Den forvarmede prøve overføres til en extraction tube, der indeholder ferrioxidpartikler i en opløselig film. Der tilsættes dernæst syre for at sænke pH-værdien og tilføre positiv ladning til ferrioxiden, som så binder til det negativt ladede DNA. Partiklerne og det bundne DNA trækkes dernæst ud i siderne af extraction tuben vha. magneter, og det ubundne materiale aspireres og bortskaffes i affaldsbeholderen. Partiklerne vaskes, og der tilsættes elueringsbuffer med høj
pH-værdi for at isolere det rensede DNA. Til sidst anvendes en neutraliseringsbuffer til at gøre
pH-værdien i den ekstraherede opløsning optimal til amplificering.
BD Viper LT-instrumentet overfører ekstraherede prøver samt positive og negative analysekontroller til en PCR plade indeholdende pelleteret mastermix. PCR-pladen forsegles med et plastik seal (en pladeforsegling). Når pladen er forseglet, lukkes den indbyggede Reader (læserlåge) over pladen. Herefter udføres amplifikation og påvisning. BD PCR-analysen er baseret på amplifikation og påvisning af fokus-DNA vha. amplifikationsprimere og en fluorescensmærket detektorprobe. I PCR processen tilsættes den ekstraherede prøve til PCR-pladen, som indeholder amplifikationsprimere, den fluorescensmærkede detektorprobe, varmeaktiveret enzym (Taq DNA-polymerase) og andre reagenser, der er nødvendige for PCR. Resultaterne rapporteres automatisk, baseret på den algoritme, der hører til det analysespecifikke reagens.
For opsætning af en kørsel se vejledningen for Viper LT
Analysering af resultat:
Tilstedeværelsen af HPV DNA bestemmes på baggrund af en Ct algoritme. Ct værdien repræsenterer det antal PCR cycler der er nødvendig for at detektion af et fluorescerende signal. Ct cut-off værdien er som standard 34,2 for HPV positivitet dog er cut-off for HPV 16 38,3.
Hvis der detekteres et fluorescerende signal for HPV med en ct værdi lavere end cut-off rapporteres denne prøve som værende positiv for den pågældende HPV type.
Resultat rapport:
Efter endt kørsel udskrives automatisk en rapport med resultater. Det kræves at begge kontroller godkendes i deres QC. Hvis der meldes QC Fail på bare en af kontrollerne ”fejler” hele kørslen. Nedenstående viser forskellige fejl der kan meldes på kontrollerne.
Hvis kørslen godkendes ”frigives” resultaterne på prøverne. Hvis man bruger ”Key cards” i Viper LT-instrumentet vil en evt HPV positiv genotype blive rapporteret. Dette vises ved følgende symboler.
Bruges der ikke ”Key cards” vil rapporten kun vise at prøven er positiv for en af de 14 HPV genotyper men ikke den specifikke genotype. Nedenstående viser symbolerne der bruges på rapporten hvis ikke ”Key cards” benyttes.
Nedenstående viser forskellige fejl der kan opstå på prøverne.
Hvis en prøve fejler i første kørsel køres den om. Er det efter to kørsler ikke muligt at få et validt resultat besvares prøven inkonklusiv.
