Målgrupper og anvendelsesområde
Definitioner
Fremgangsmåde
Ansvar og organisering
Referencer, lovgivning og faglig evidens samt links hertil
Bilag
Målgrupper og anvendelsesområde
Bioanalytikere, videnskabeligt personale, assistenter og molekylærbiologer.
Allplex HPV28 kittet anvendes til at diagnosticere op til 28 kendte HPV genotyper ved hjælp af real-time PCR teknologi.
Allplex II HPV28
Allplex II HPV28 kittet (Seegene) detecterer 28 individuelle HPV genotyper. 14 høj-risiko typer (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 & 68) samt 18 lav-risiko typer(6, 11, 26, 40, 42, 43, 44, 53, 54, 61, 69, 70, 73 & 82).
Til PCR benyttes en CFX96 Real-time PCR maskine og til analysen benyttes CFX96 Real-time PCR detection System (CFX Manager Software)
Princip
Allplex HPV28 er et multiplex real-time PCR assay der amplificerer samt detekterer 28 forskellige HPV genotyper og Interne Kontroller (IC). Assayet benytter Seegene's innovative teknologier DPO, TOCE, MuDT og 3 Ct teknologien. 3 Ct teknologien kan give ct-værdier for 3 targets i en kanal uden at give afkald på sensitivitet eller specificitet. Tilstedeværelsen af en specifik gensekvens (f.eks en HPV genotype) rapporteres som en ct-værdi i Seegene Viewer softwareen.
Allplex benytter et humant house-keeping gen som Intern Kontrol (IC) for at vurdere kvaliteten af DNA ekstraktionen og PCR reaktionen.
Uracil-DNA glycosylase (UDG)-dUTP systemet er indbygget i Allplex assayet for at undgå kontaminering med amplicons.
Kontroller
Der er 3 Positive kontroller (PC1, PC2 og PC3) og en Negativ kontrol (RNase-free Water) inkluderet i kittet.
Hver PC indeholder kloner for 5 targets i Mastermix A og 5 tartets i Mastermix B. Targets er både HPV genotyper og Intern kontrol (IC).
Kontroller sættes op til PCR i henhold til skema.
På nedenstående skema ser hvilke targets der er positive i hvilken kontrol.
Prøve materiale og DNA ekstraktion
Allplex HPV28 assayet kan benyttes til analyse på FFPE prøver, SurePath prøver, HPV-Hjemmetest samt Swab prøver (podningsprøver). Dette er internt valideret.
DNA skal ekstraheres inden brug i forbindelse med analysen. Denne DNA ekstraktion skal foregå efter de gældende vejledninger for den pågældende prøvetype.
PCR skema
Inden en kørsel oprettes et skema der giver overblik over hvilke prøver der analyseres.
Dette skema bruges hver gang der pipetteres prøvemateriale til en PCR tube så man kan sammenligne Rekv nr og dermed sikre at det er den korrekte prøve der analyseres.
- Der printes et skema (
Nyt skema.docx) - Labels med Rekv nr påklistres skema.
- Er prøven en omkørsel skrives "OM" ved Rekv nr
- Er prøven fortyndet skrives fortyndingen f.eks "1:1" eller "fort" ved Rekv nr
Skema gemmes da det følger prøverne hele vejen gennem analysen
Opsætning af kørsel på CFX
Inden man sættes PCR op oprettes kørslen i Bio-Rad CFX Manager software.
Se vejledning side 1-3
Kort brugervejledning til CFX96 Manager og SeeViewer_Hvidovre PAT_Allplex HPV28.docx
Opsætning af Real-time PCR
Alt arbejde med PCR opsætning foregår i flowbænk.
Til opsætning af PCR skal bruges følgende plastvarer;
- 1,5 ml eppendorf rør
- Optical Flat 8-Cap Strips (Cat. no. TCS0803, Bio-Rad)
- Low-Profile 0.2 ml 8-Tube strips, white (Cat. no. TLS0851, Bio-Rad)
- Alternativt til 8-Tube strips bruges PCR plade fra Bio-Rad
Alle reagenser optøes hvorefter de opbevares (kortest muligt) på is/i køleblok.
Alle reagenser centrifugeres kort inden brug.
Fremstilling af PCR Mastermix:
Vigtigt at man benytter den tilhørende Quick Guide Allplex PCR opsætning Quickguide.doc
Der benyttes to forskellige PCR Mastermix (Mix A og Mix B)
Note: Mængden af Mastermix beregnes ud fra antallet af reaktioner (prøver + kontroller). Der fremstilles max 10% mere Mastermix end der er brug for.
Hvert rør med Mastermix vendes 5 gange og centrifugeres kort. MOM skal vortexes meget grundigt lige inden brug.
Det nødvendige antal PCR strips placeres i en køleblok og nummereres. Det er vigtigt der ikke er tvivl om nummereringen af strips i tilfælde af de bliver forbyttet.
Der aliquoteres 15ul PCR Mastermix til hver PCR tube (i henhold til skema).
For Positive kontroller tilsæt 5 ul af PC1, PC2 og PC3 (i henhold til skema).
For Negativ kontrol tilsæt 5 ul RNase-free Water (i henhold til skema).
Der tilsættes 5ul DNA til hver PCR tube (i henhold til skema). Det er vigtigt at Rekv nr på prøverør sammenlignes med Pato ID på skema inden DNA tilsættes.
Hver strip lukkes med Optical Flat 8-Cap Strips.
Herefter centrifugeres PCR tubes kort, inden de sættes i CFX96 PCR maskinen. Det er vigtigt de står i maskinen som på skema.
Analysering af resultater
Efter endt kørsel eksporteres resultaterne så disse kan videre behandles i Seegene Viewer
Se vejledning side 4-7
Kort brugervejledning til CFX96 Manager og SeeViewer_Hvidovre PAT_Allplex HPV28.docx
For at kontrollerne i en kørsel er valide skal de opfylde nedenstående kriterier. Ct-værdien skal være mellem 15 og 31.
De 28 individueller HPV genotyper analyseres med forskellige flourofoer i de to mastermix jvnf nedenstående tabel
Cut-off værdier for detektion af HPV i en prøve er 43 jvnf nedenstående
Besvarelse af prøver
Alle prøver besvares i henhold til gældende forskrifter for den pågældende prøvetype