Bestemmelse af lipasekoncentration i duodenalsekret.

Lipase er et enzym, der produceres i pancreas (bugspytkirtlen) og udskilles til duodenum (tolvfingertarmen). Lipase medfører en spaltning af fødens fedt (triglycerid), hvilket er en forudsætning for, at fedtet efterfølgende kan absorberes i tyndtarmen. En af komplikationerne til kronisk pancreatitis (kronisk bugspytkirtelbetændelse) er eksokrin pancreasinsufficiens, der medfører nedsat lipaseudskillelse. I svære tilfælde er lipasekoncentrationen i duodenum for lav til at opretholde den normale doudenale fedtspaltning. Følgelig øges fedtindholdet i fæces, og der kan udvikles steatore (fedtdiare). Måling af lipasekoncentrationen i duodenum har derfor stor betydning ved udredningen af diaré tilstande.

På følgende figur ses, at det først er ved ret lav lipasekoncentration, at fedtindholdet i fæces stiger.

Fig. 1: Fedtindhold i fæces ( g pr. døgn) som funktion af den postprandiale lipase-

koncentration i duodenum (kU/l) hos patienter med kronisk pancreatitis.

Målgruppe og anvendelsesområde

Denne instruks er gældende for alle medarbejdere, der udfører denne undersøgelse/behandling i klinisk fysiologisk/nuklearmedicinsk sektion, Funktions- og Billeddiagnostisk Enhed, Hvidovre Hospital.

Forberedelse

Analyseprincip

Pancreaslipasen katalyserer hydrolysen af ester-bindinger i triglyceroler. De frigjorte carboxylgrupper titreres kontinuerligt (pH-stat teknik) med natriumhydroxid. Enzymindholdet i reaktionsblandingen er, inden for visse grænser, proportional med de frigjorte carboxylgruppper. Enzymmængden kan derfor beregnes ud fra natriumhydroxidforbruget under titreringen. Som substrat anvendes olivenolie, hvis væsentligste indhold er triolein. Den enzymatiske reaktion forudsætter tilstedeværelse af galdesyrer i en fixeret koncentration.

Enzymmængden defineres ved spaltningshastigheden. Den enzymmængde, der katalyserer frigørelsen af 1 µEq syre pr. min. er lig med 1 enzym unit (U). Koncentrationen opgives i kilo-units pr. liter duodenalsaft (kU/l)

Apparatur

1 Autoburette ABU 901

1 pH-stat controller PHM 290

1 Omrører TTA 80

1 Termostateret kappe

1 Kombineret pH-elektrode

1 Skriver REA 270 pH STAT UNIT med REA 160 titrigraph modul

1 vandtermostat (vandbad) 25⁰ C

Finnpipette 1-5 ml

Finnpipette 100 -1000 μl

Microman 250 M

Stopur

Reagenser

Trisbuffer 0.005 N / 5 mmol/L, pH 9.0 (Apoteket)

HCL 0.1 N / 0,1mol/L (Apoteket)

NaOH 0.1 N / 0,1 mol/L (Apoteket)

NaOH 0.05 N /50mmol/L (Apoteket)

Buffer opløsning pH 4.005 og pH 7.00 (Radiometer)

NaCl 0.9 mg/ml

Substrat (olivenolieemulsion)

Gummiarabicum 10 % w/v filtreret (Apoteket) 100 ml

Knust is 5 g

Olivenolie til analysebrug (Apoteket) 17,5 ml

Gummiarabicum og knust is blendes i ca. 2 min. Blend kun lidt tid ad gangen, da blenderen ellers bliver for varm. Olivenolien tilsættes lidt ad gangen og substratet blendes grundigt i ca. 6 min. Substratet er holdbart ca. 1 uge i køleskab.

Galdesyreopløsning (8% W/v) (Apoteket)

Sodium taurocholate SIGMA-4009 0,5 g

Ionbyttet vand 6.25 ml

Galdesyreopløsningen vendes på roterapparatet indtil at taurocholaten er opløst. Opløsningen er holdbar i 1-2 uger i køleskab.

Når der tages et nyt Lot nr. i brug, er det nødvendigt at finde den mængde galdesyre-opløsning, der skal tilsættes for at opnå optimale værdier. Der laves en kurve med en tidligere analyseret prøve. Prøvemængden fastholdes, mens galdesyreopløsningsmængden varieres fra f.eks. 25 μl til 200 μl. Den mængde der giver den højeste lipaseværdi anvendes.

Alle reagenser opbevares i køleskab, undtagen olivenolie og taurocholat som står i vejerummet.

Klargøring af apparatur

Der hældes frisk NaOH 0,05 N i flasken og systemet skylles igennem indtil der ikke er luftbobler i systemet.

Tryk på Method,

tryk ▼ x 2,

tryk ► til der står Flush i displayet,

Tryk OK .

Elektroden

Kontroller at der er lidt synlige krystaller i KCl+AgCl-opløsningen, at opløsningen er ca. 0.5 cm under påfyldningshullet og uden luftbobler. Mangler der krystaller fyldes lidt flere i opløsningen. Er der er for mange eller klumper tømmes elektroden helt med en 1 ml sprøjte + venflon. Skyl med 0,9 mg/ml NaCl indtil alle krystaller er fjernet -1x skulle være nok. Påfyld mættet KCl+AgCl x 2 og vend. Påfyld igen KCl+AgCl og tilsæt også lidt KCl krystaller, se også vejledningen i kassen med rens og krystaller. Elektrodens tilhørende clips sættes i påfyldningshullet.

Kalibrer elektroden med pH 4.005 og pH 7.00.

Kalibrering af elektroden

1. Tryk cal. Displayet vil vise, hvilke buffere vi bruger (IUPAC)

2. Indtast temperatur for bufferne ( = rum temperatur – der ligger et termometer i skabet) og tryk V.

3. pH-metret spørger efter buffer 7,0. Elektroden sættes i bufferen, omrøren startes og der trykkes på V.

4. Når kalibreringen på pH 7,0 er færdig, spørger pH-metret om buffer 4,005. Elektroden aftørres og sættes i buffer 4,005. Start

omrøren og tryk V.

5. Efter endt kalibrering vises zeropH og sensitivity i displayet. Værdierne skrives i logbogen. Er kalibreringen ikke ok, vises en

fejlmelding i displayet.

Hvis elektroden er lang tid om at indstille sig, kan det give problemer med at nå at analysere prøverne. Rens derfor elektroden, påfyld ny KCl+AgCl opløsning, og kalibrer på ny.

Skriverindstilling

REA 270 pH stat unit sættes på OFF. PEN stilles på SERVO. SPAN på 2,8 og SCALE ZERO på 0,00. Pennen monteres i holderen. Positionen reguleres vha. de to penskruer. CHART FEED sættes på 1min./cm. For at starte skriveren skal remote stå på down og papirfremførings knappen skal stå på ▼.

Fremgangsmåde

Inden patient prøverne analyseres, måles tre normalitetsbestemmelser og en blind-bestemmelse efter nedenstående skema:

###TABEL_1###

Titrering

Normalitets bestemmelse af NaOH-opløsningen:

Afpipetér efter skemaet og anbring medicinbægret i termostatkoppen. Start omrøreren.

Titreringen startes:

Tryk Method

Tryk ► til der står “Method A pH-stat PID” i displayet.

Tryk dernæst Sample, der står nu hvornår apparatet sidst er kalibreret (der skal altid kalibreres samme dag før analyse).

Tryk OK, temperaturen skal nu indtastes.

Tryk OK og titreringen starter.

Når der kommer tal i displayet startes papiret. Når antal forbrugt μl NaOH ikke stiger mere, er titreringen færdig og der stoppes på method.

Antal forbrugt μl NaOH aflæses og noteres på papirstrimlen. Ny måling: tryk sample og fortsæt som ovenfor.

Beregning af NaOH-opløsningens normalitet:

N_b = ___ _500 μl x N_s______________ , hvor N_b = NaOH-opløsningens normalitet (mN)

forbrugt μl NaOH N_s= HCL´s normalitet (mN)

Eksempel:

Forbrugt NaOH = 1004 μl

N_b = _____500 μl x 100mN_______ = 50 mN

1004 μl

Normalitetsbestemmelsen plejer at ligge omkring 45mN. Er værdien < 40, er NaOH for gammel og der skal bestilles en ny.

N_b opgives som middeltal af 3 bestemmelser.

Blind og prøver:

Afpipettér efter skemaet i et medicinbæger. PH er som regel under 7 i den afpipetterede blanding. For hurtigt at nå et pH på 9,10 tilsættes 1-2 dråber NaOH 0.1N. Bægeret sættes i termostatkoppen og titreringen startes ligesom ved normalitetsbestemmelse. Der titreres først til pH 9.10, herefter titreres de frigjorte carboxylgrupper og stopuret startes. Efter en inkubation på 2 min. startes den egentlige måling, og antal μl forbrugt NaOH aflæses (tiden "0 min"). Titreringen afsluttes efter 3 min., dvs. i alt 3+2 = 5 min., ved at trykke på Method. Antal forbrugt μl NaOH aflæses og noteres (tiden "3 min"). Se også nedenstående ”tidslinie".

PH stiger pH 9,1 2 min 5 min

___l______________l_______(2min)_________l__________(3min)____________l________

start ur 0 min/aflæs 3 min/aflæs

Start: omrører Stop: på method

tryk sample omrører

papir papir

Blindværdien skal være < 10 μl forbrugt NaOH pr. min. Hvis værdien er større, er der formentlig noget galt med substratet.

Tag prøverne ud af fryseren én ad gangen, de skal tø op lige inden analysering. Medtag en "gammel" prøve som intern kontrol. Lav kun enkeltbestemmelse. Prøven holder sig ikke så godt og kan afvige med 10%.

Ud fra amylasesvaret vurderes om lipaseprøven skal fortyndes. Oftest vil amylasekoncentrationen og lipasekoncentrationen følges ad. Det vil sige, begge være normale, nedsat eller for høje. Prøverne analyseres ufortyndet ved meget lav amylasekoncentration eller fortyndet 1:6, 1:10 eller 1:15 alt efter amalyaseniveau med 0,9 mg/ml NaCl. Der udføres dobbeltbestemmelse.

Kurven skal være retlinet for alle prøver: normalitet, blind og prøver ellers analyseres prøven igen. Er kurven ikke retlinet og i stedet bøjer af, er prøven formentlig for stærk og der er derfor ikke tilstrækkelig med substrat tilstede. Prøven skal derfor fortyndes yderligere.

Elektroden skylles med ioniseret vand mellem hver titrering og duppes med gaze.

Beregning af lipaseaktivitet:

Lipaseaktiviteten = __b x N_b x evt. f__ U/ml = kU/L b = volumen NaOH forbrugt på 3 min (μl)

3 x X N_b = NaOH-opløsningens normalitet (mN)

f = fortyndingsfaktor f.eks. 6 eller 10

X = volumen af prøve = 75 μl

Eksempel:

b = 182 μl (0 min = 738 μl, 3 min = 920 μl. (920 μl - 738 μl) = 182 μl)

N_b = 44 mN

f = 6 (fortyndet 1:6)

X = 75 μl

Lipaseaktiviteten = __ _182 μl x 44 mN x 6____ = 214 kU/L

3 min. x 75 μl

OBS. Hvis pH < 5, er lipaseprøven fortyndet 1+3. Lipaseresultatet skal derfor ganges

med fortyndingsfaktor 4 (1+3= x 4). Se lipaseskema for pågældende prøve i

lipasemappen.

Antal μl forbrugt NaOH skal helst ligge mellem 100 og 300 μl ved fortyndede prøver. Hvis prøven analyseres ufortyndet og titreringstallet, dvs. forbrugt mængde NaOH, bliver mindre end 100, trækkes blind fra titreringstallet.

Resultatet opgives som middelværdi af 2 bestemmelser.

Variationskoefficienten (værdi 1 - værdi 2) x 100% må ikke overstige 12 %.

Middel

Fejlkilder

Meget viskøst sekret kan medføre usikkerhed ved afpipettering.

For tidlig optøning af prøverne.

Unøjagtig afpipettering af substratet.

Luftbobler i slangerne.

Referenceområde

Lipase: 264 - 1333 kU/L

Svarafgivelse

Resultatet skrives ind i svararket 06.2.HH.6.14. Formular a. Pancreasfunktionstest og i lipasearket 06.2.HH.10.12. Formular b. Lipaseark i lipasemappen. Alle prøveresultater inklusiv normalitetsbestemmelse og blind noteres i lipasearbejdsarket 06.2.HH.10.12. Formular c. Lipase arbejdsark i mappen. Svararket kopieres og resultatet tastes ind i Qdoc og lægges til godkendelse hos den ledende bioanalytiker. Efter godkendelse lægges papirerne til forvagten. Originalen gemmes i lipasemappen.

Oprydning

Buretten gennemskylles med vand.

Elektroden skylles i ionbyttet vand og renses 5-20 min. i renovo.n rens og bagefter 3 min. i renovo.x rens. Elektroden skylles 1 min. i ionbyttet vand og står 20 min. i buffer 4 eller 7, se også vejledningen i kassen med rens og krystaller. Påfyldningshullet lukkes til med tætsluttende parafilm, elektrodespidsen beskyttes med den tilhørende plasthætte fyldt med mættet KCl og sættes med spidsen nedad.

Vedligeholdelse

Elektroden kalibreres før pH måling.

Elektroden renses efter behov. Hvis sensitiviteten er < 97 % renses med renovo.x rens. For yderligere vejledning, se også vejledningen i kassen med rens og krystaller og insert til elektroden.

Analyserede prøver kasseres efter 6 mdr.

Ansvar og organisering

Superbrugeren har ansvaret for udarbejdelse og vedligeholdelse af instruksen.

Sektionsledelsen har ansvar for godkendelse og realisering af instruksen.

Alle ansatte som bestemmer lipasekoncentration har ansvar for at følge denne instruks.

Formularer

06.2.HH.6.14. Formular a. Pancreasfunktionstest.

06.2.HH.10.12. Formular b. Lipaseark