Formålet med denne vejledning er at beskrive hvad endotoxiner er og hvor hvordan koncentrationen af disse kan måles med Netgen-PTS.
Denne instruks gælder for alt personale på Klinisk fysiologisk/nuklearmedicinsk afdeling, Bispebjerg Frederiksberg Hospital, som er en del af produktionen og kvalitetskontrollen af [15O]H2O.
Endotoksin (lipopolysakkarider) er en gruppe af skadelige stoffer, som findes i cellevæggene hos gram-negative bakterier. Lipiddelen af molekylet skaber toksiciteten. Når bakterierne dør, går cellevæggen i opløsning og endotoksin frigives. Endotoksiner i injicerede lægemidler er særligt skadeligt da de både er inflammatoriske og pyrogene.
Endotoksiner forbliver stabile, når de udsættes for høje temperaturer, det vil sige at normale steriliseringsmetoder, såsom autoklavering, ikke virker mod dem. Endotoksiner er hydrofobe, hvilket betyder, at de kan sætte sig på overfladen af andre hydrofobe materialer, såsom laboratorieudstyr af plastik.
Endotoksin måles ved hjælp af blodet fra dolkhaler. Blodet har en særlig evne til at koagulere, når der er endotoksin til stede. Endotoksiner kan detekteres i meget lave koncentrationer ved brug af den følsomme LAL (Limulus amoebocyte Lysate) test. Ved chromogenic bacterial endotoxin test anvendes et specielt behandlet LAL. Når dette lysat reagerer med en endotoksin frembringes en gul farve. Testen måler hastigheden på dannelsen af denne farvereaktion.
Cartridges anvendes til LAL-tests på Endosafe. For hver enkelt cartridge er der fremstillet en standardkurve med reaktionstiden som funktion af endotoksin koncentrationen (EU/ml, endotoksin units per milliliter). En cartridge indeholder fire måleceller (optiske celler), hvor der er to til prøven (celle 1 & 3) og to med en tilsat kendt koncentration af endotoksin og lysat (positve product control). Nexgen-PTS læseren måler reaktionstiden i hver målecelle. Reaktionstiden anvendes til, ved hjælp af standardkurven, at bestemme koncentrationen af endotoksiner (EU/ml) i prøven og i positve product control. Cartridges fås med forskellige følsomheder. Til måling af [15O]H2O anvendes normalt cartridges med følsomhed 10.0-0.1 EU/ml, men der kan anvendes andre følsomheder, og så vil det fremgå af den produktspecifikke instruktion.
Alle utensilier som anvendes til LAL-test skal være endotoxinfri. Følgende utensilier anvendes:
1. 2-200 µl endotoxinfri pipettespidser (LS)
2. 100-1000 µl endotoxinfri pipettespidser (LR)
3. Borosilicat reagensglas (LG)
4. LAL-reagensvand (LW)
5. PTS 10.0-0.1 EU/ml cartridges (LC)
Resultatet foreligger efter ca. 15 min (printes automatisk). Displayet viser følgende oplysninger:
Sample Value (EU/ml)
Sample Rxn Time CV (%) SKAL VÆRE< 25% ellers gentages testen!
Spike Value (EU/ml)
Spike Rxn Time CV (%) SKAL VÆRE <25% ellers gentages testen!
Spike Recovery (%) SKAL VÆRE mellem 50-200% ellers gentages testen!
Resultatet (Sample Value) noteres på arbejdssedlen for fremstilling og QC af [15O]H2O og vedlægges batch dokumentationen.
Typiske fejl:
Hvis Spike Recovery er for lav, kan der være tilsat et for stort volumen (>25 µl) til målecellerne.
Hvis Spike Recovery er for højt, kan der være tilsat et for lille volumen (<25 µl) til målecellerne.
Hvis CV> 25% kan der være bobler i de optiske celler