CLART ENTHERPEX (HERPES)

 

Bioanalytikere og molekylærbiologer i molekylærlaboratoriet

Påvisning og typebestemmelse af Herpes og Human enterovirus via genomisk identifikation ved hjælp af micro-array teknologi.

CLART ENTHERPEX er et "ready to use" kit fra Genomica indeholdende PCR Mastermix, micro-arrays og visualiserings reagenser.

 

Tilbage til top

ENTHERPEX testen omtales ofte som HSV analyse eller Herpes analyse

 

Tilbage til top

CLART ENTHERPEX (Mikroarray basseret assay)  

Formål:

Påvisning og typebestemmelse af Herpes og Human enterovirus via genomisk identifikation ved hjælp af micro-array teknologi.

 

Teori:

CLART ENTHERPEX analysen består af en PCR efterfulgt af en visualisering.

CLART ® ENTHERPEX kit detekterer tilstedeværelsen af humane herpesvira samt de tre mest relevante Enterovira. Dette sker vha genotypebestemmelse som er baseret på virale genom-specifikke fragment amplifikationer, der efterfølgende påvises ved hjælp af en hybridisering med specifikt bindende probe array.

 

Sikkerhed:

Amplifikation:

Al Pre-PCR arbejde, sker i ”grønt” rum (ampliconfri zone), i en LAF bænk med flow. Der bruges handsker og kittel.

Visualisering:

Post-PCR arbejde foregår i ”rødt” rum (amplicon zone). Kittel anvendes.

 

QA/QC:

Intern kvalitetssikring:

For hver kørsel kontrolleres de indbyggede kontroller i assayet samt en NTC kontrol fra ekstraktionen (vand). Kan en kørsel ikke godkendes grundet fejlede kontroller skal kørslen køres om.

 

Fremgangsmåde:

Som udgangspunkt kan analysen køres på alle materialer hvori der er mistanke om Herpes virus.

Kittet er valideret til følgende prøve typer:

Podninger, serum, plasma, spinalvæske samt FFPE materiale.

• FFPE prøver:
  • "oversigt/klarmeld" åbnes i patologi systemet. Dette findes under "dagligt funkt."
  • Der laves en søgning (på glas niveau) af nye bestiller på Herpes (farvning).
  • Vævs blokkene findes frem i blok arkivet.
  • Vævene skæres i henhold til forskrift Skæring af FFPE væv til PCR 
  • DNA ekstraheres fra blokkene i henhold til forskriften Oprensning af DNA fra formalinfikseret paraffinindstøbt væv (FFPE)

 

• Podninger:
  • Podningerne hentes i prøvemodtagelsen efter udpakning af dagens post.
  • Alle podninger er oprettet med elektronisk rekvisition. Denne hentes under "Hent elektronisk rekv." under "daglig funkt." Herefter oprettes rekvisition i patologi systemet og etiket med Rekv nr printes automastisk.
  • Materialet overføres til et 1,8ml nunc rør mærket med rekv. nr.
  • Podningerne vortex mixes inden de overføres til deres respektive nunc rør.
  • DNA ekstraheres på MagNA Pure96 platformen eller BD MAX platformen.

 

• SurePath prøver:
  • I sjældne tilfælde ønskes en SurePath prøve undersøgt for Herpes virus.
  • Hvis prøven er oprettet i Patosystemet oprettes et nyt glas med farvningen "Herpes" og der printes en ekstra etikette med Rekv. nr.
  • Hvis ikke prøven er oprettet skal der laves en rekvisition på denne i Patologi Systemet. 
  • Etikette med Rekv. nr påsættes et 1,5ml eppendorf rør.
  • Prøven vortex mixes og der udtages 1ml materiale til eppendorf rør.
  • Prøven centrifugeres i 5 min ved 14500rpm.
  • Supernatanten fjernes og der tilsættes 180 µl PBS 7pH 7,4 og 20 µl Proteinase K.
  • Inkubering ved 56 °C i en time ved 550 rpm. (kan efterlades natten over ved 56 °C)
  • Inkubering ved 90 °C i en time ved 550 rpm.
  • Herefter ekstraheres DNA på MagNA Pure96 eller BD MAX platformen.

 

Ekstraktion:

FFPE prøver

Ekstrahering af DNA ved hjælp af Maxwell  eller manuelt se instruks Oprensning af DNA fra formalinfikseret paraffinindstøbt væv (FFPE)

Podninger

Ekstrahering af DNA kan ske ved hjælp af MagNa Pure96 (se instruks MagNA Pure 96) eller BD MAX.

SurePath prøver

Ekstrahering af DNA ved hjælp af MagNa Pure96 (se instruks MagNA Pure 96) eller BD MAX

    

PCR:

Plade layout oprettes ved brug af HSV skabelonen: CLART Herpes skabelon.xls. Skema findes under: P:\Patologiafdeling\134\Molekylær Patologi Laboratorium\MPL Rutiner\Herpes.

• Skabelonen printes ud samt gemmes elektronisk i en nyoprettet mappe (navngivet med dagens dato) under: P:\Patologiafdeling\134\Molekylær Patologi Laboratorium\MPL Rutiner\Herpes\år\måned.
• HSV mastermix PCR-rør (hvidt og grønt) anbringes på fryseblok og nummereres i overensstemmelse med skabelonen.
• Tø HSV mastermixen op og tilsæt 2 µl enzym til de grønne rør.
• Tilsæt 5µl DNA til hvert rør og bland med pipetten.
• Alle Rør sættes på en PCR maskine
• PCR maskinen startes på HSV amplifikationsprogrammet.

 

Amplifikationsprogrammet tager ca 3½time (varrierer alt efter PCR maskine):

###TABEL_1###

 

Denaturering af PCR produkt:

Efter endt PCR kørsel, skal prøverne denatureres. Vælg HSV denatureringsprogrammet.

Programmet tager 10 min:

###TABEL_2###

Efter endt denaturering anbringes prøverne med det samme på køl i en fryseblok.

 

Visualisering af array:

Visualisering udføres manuelt.

1. Tænd for thermomixeren på 59°C
2. SH (Hybridiserings bufferen) skal have stuetemperatur før den benyttes. Hvis der findes salt krystaller i SH bufferen, opvarmes denne til 50°C, for at opløse krystallerne igen.
3. Fremstil TL-buffer:
   • 4 prøver   = 0,5 ml TL buffer + 4,5 ml destilleret vand
   • 8 prøver   = 1 ml TL buffer + 9 ml destilleret vand
   • 16 prøver = 2 ml TL buffer + 18 ml destilleret vand
   • 32 prøver = 4 ml TL buffer + 36 ml destilleret vand
4. Tag det ønskede antal array-strips frem, som matcher med antal prøver og anbring i en hvid ramme.
5. Mærk tydeligt det enkelt array-strips.
6. Skyl arrays med 200µl TL buffer.
7. Fjern al TL bufferen, så arrayene er fuldstændig tørre.
8. Tilsæt 100µl SH buffer.
9. Tilsæt 5µl PCR produkt fra hvid og grøn tube.
10. Sæt låg på arrayene i den hvid ramme.
11. Indkuber på thermomixer i 1 time, på 59°C ved 550 rpm. (Hybridisering af PCR produkt og prober på arrayet)
12. Tænd CAR-Reader'en, vælg Herpes aflæsning og indtast prøver.
13. Efter en times inkubering tages arrays af.
14. Sæt thermomixeren på 30°C og på 15 min. (Fjern evt. låget, for nedkøling kan gå hurtigere)
15. Fjern al væske fra arrays.
16. Vask med 200µl TL buffer.
17. Ryst arrayene på thermomixeren ved 550 rpm. i 15 sek.
18. Fjern al TL-buffer. (Rens vacum sug med DNA away og vand mellem hver strip, grundet kontamineringrisici). 
19. Vask igen med 200µl TL buffer.
20. Ryst arrays på thermomixeren ved 550 rpm. i 15 sek.
21. Efterlad arrayet med 200µl TL buffer indtil thermomixeren har nået 30°C.
22. Fjern al TL-buffer. (Rens vacum sug med DNA away og vand mellem hver strip, grundet kontamineringrisici). 
23. Fremstil CJ/DC opløsningen, lige før brug.
    •  8 prøver =  1ml DC buffer  + 7,5µl CJ buffer
    • 16 prøver =  2ml DC buffer  + 15µl CJ buffer
    • 32 prøver =  4ml DC buffer  + 30µl CJ buffer
24. Tilsæt 100ul CJ/DC opløsning.
25. Indkuber på thermomixer i 15 min. på 30°C ved 550 rpm.
26. Efter 15 min. inkubering tages arrays af.
27. Sæt thermomixeren på 25°C
28. Fjern al CJ/DC opløsning.
29. Vask med 200µl TL buffer.
30. Ryst arrays på thermomixeren ved 550 rpm. i 15 sek.
31. Fjern al TL buffer.
32. Vask igen med 200µl TL buffer.
33. Ryst arrays på thermomixeren ved 550 rpm. i 15 sek.
34. Fjern al TL buffer.
35. Vask igen med 200µl TL buffer.
36. Ryst arrays på thermomixeren ved 550 rpm. i 15 sek.
37. Efterlad arrayet med 200µl TL buffer indtil thermomixeren har nået 25°C
38. Fjern al væske fra arrays.
39. Tilsæt 100µl RE-buffer.
40. Sæt låg på arrays.
41. Anbring på thermomixer på 25 °C i 10 min., uden ryst.
42. Fjern al væske efter endt inkubation.
43. Klar til aflæsning på CAR.

 

Kørsel på CAR Reader:

Se separat forskrift for Genomica CAR reader

• Isæt arrays på metalpladen og følg instruks på skærm.

• Efter endt aflæsning sættes kryds på de array der er brugt og strippen gemmes i skabet i rødt rum.
• Al data eksporteres til USB stik. 

 

Besvarelse:

• Data overføres fra USB stik til den oprettet mappe under: P:\Patologiafdeling\134\Molekylær Patologi Laboratorium\MPL Rutiner\Herpes\år\måned.
• Runreporten printes og sammenholdes med rådata (billede) evt. kommentar/tilføjelser noteres på runreporten. Ved uoverensstemmelse eller tvetydigt resultat kontaktes en akademiker.
• Vær obs på at CLART ® ENTHERPEX arrayet indeholder ikke en DNA kontrol.

 

Besvarelse af FFPE prøver og SurePath:

Internt bestilte prøver besvares med standardtekster i Patologi systemet under "Interne noter" i "undersøger note".

Et svar bygges altid op på samme måde;

DD-MM-ÅÅÅÅ: Standardtekst/initialer

Koden markeres, tryk CTRL + T og standardteksten kommer frem.

Figur over svar muligheder:

###TABEL_3###

**Ved <<>> tilføjes "herpes"

 

*Ved <<>> tilføjes den påviste Herpes vira

Herpes kittet indeholder følgende 8 vira:

• Herpes Simplex Virus 1 (HSV1)
• Herpes Simplex Virus 2 (HSV2)                                            
• Varicella Zoster Virus (VZV)
• Cytomegalovirus (CMV)
• Epstein Barr Virus (EBV)
• Human Herpes Virus 6 (HHV6)
• Human Herpes Virus 7 (HHV7)
• Human Herpes Virus 8 (HHV8)
• Enterovirus (EV)

Enterovirus (EV) besvares ikke, idet det ikke ligger inden for afdelingens kompetencer.

Svar gennemgås med anden autoriseret bioanalytiker eller akademiker inden status skiftes til "Klar" i patologi systemet.

 

Besvarelse af podninger:

Ekstern bestilling på HSV analysen besvares direkte i patologi systemet  under "daglige funk." i "Diagnose registrering".

Et svar bygges altid op på samme måde;

T-kode

MÆ0025

P33B36

Fritekst (standardteksten med Herpes svaret)

Svar gennemgås med anden autoriseret bioanalytiker eller akademiker inden de frigives fra patologi systemet.

 

Arkivering af resultater:

• Efter endt kørsel, skal HSV opsættet indeholde følgende:

  • HSV skabelon.
  • Run report fra CAR.

• Dette arkiveres i mappen samt elektronisk under P:\Patologiafdeling\134\Molekylær Patologi Laboratorium\MPL Rutiner\Herpes\år\måned.

 

Tilbage til top

Den kvalitetsansvarlige har ansvaret for opdateringer i instruksen.

Tilbage til top

http://genomica.es/en/in_vitro_diagnostics_products_clart_entherpex.cfm

 

Tilbage til top

 

Tilbage til top

Herpes array quick guide.doc

CLART Herpes skabelon.xls

Tilbage til top